酚类化合物荔枝酵素：至少含有24种酚类化合物

2022-02-24 07:54

荔枝是无患子科荔枝属常绿乔木，高约10米。果皮有鳞有斑，鲜红色和紫色。成熟至鲜红色；种子都被肉质假种皮包裹。春天开花，夏天结果。果肉新鲜时呈半透明状，似脂肪，味道鲜美，但不耐贮藏。

营养含量:荔枝营养丰富，包括葡萄糖、蔗糖、蛋白质、脂肪、维生素A、B、C，以及叶酸、精氨酸、色氨酸等多种营养素，对人体健康非常有益。荔枝具有健脾生津、理气止痛的功效，适用于身体虚弱、病后津液不足、胃寒疼痛、疝气疼痛等。现代研究发现，荔枝能滋养脑细胞，改善失眠健忘多梦，促进皮肤新陈代谢，延缓衰老。

酚类化合物主要包括黄酮类化合物和酚酸类化合物，具有很强的抗氧化作用，还具有降血脂、凝血血小板、抗炎、抗癌等功能。水果中的酚类化合物包括单宁、鞣质和酚酸，如没食子酸、鞣花酸、花青素、儿茶素和阿魏酸。荔枝果肉中可检测到没食子酸、绿原酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、芦丁、槲皮素、山奈酚、反式肉桂酸和天竺葵-3-O-葡萄糖苷等酚类化合物。水果中的酚类化合物除了自身的以外，还可以通过微生物发酵的生物转化产生。

近年来，荔枝发酵饮料和酵素的研发也有报道。例如，陆嘉怡研究了乳酸菌发酵对荔枝汁中γ-氨基丁酸含量的影响；以粘度和浊度为指标，对荔枝汁乳酸菌发酵饮料的发酵工艺进行了优化。罗微等研究了用酵母和乳酸菌发酵荔枝汁开发低醇饮料；王等以总酸含量为指标，优化了红茶菌在荔枝汁中的发酵条件；以超氧化物歧化酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性为指标，益对荔枝汁混合发酵工艺进行了优化。然而，以总酚含量为指标的荔枝酵素发酵工艺的研究和优化却很少。

本研究以荔枝汁为原料，以总酚含量为指标，通过单因素和正交试验对荔枝酵素的发酵工艺进行优化，采用高效液相色谱法分析荔枝酵素中酚类化合物的生物转化，为进一步研究和阐明其转化机理，进而为富含特定酚类化合物、具有特定功能的荔枝酵素的定向研发奠定基础。

荔枝酵素发酵工艺

荔枝酵素的发酵过程包括荔枝汁提取、菌种培养和接种发酵等主要步骤。

荔枝榨汁:取新鲜荔枝，去皮去核，取荔枝肉，用无菌水冲洗2 ~ 3次，用酒精对榨汁机进行消毒，将榨汁机的汁液挤在荔枝肉上，用无菌纱布过滤，得到纯净的荔枝汁，保存在-20℃备用。

菌种培养:分别培养酿酒酵母、醋酸杆菌和植物乳杆菌，直至对数生长期中后期。

接种发酵:按单因素和正交试验要求，测菌液，4℃离心10分钟，转速10000r/min，弃上清液取菌，用无菌生理盐水洗菌两次。荔枝汁每瓶装100毫升，按照单因素和正交试验的要求接种相应的菌种或组合菌种进行发酵。

结果和分析

总酚测定标准曲线的绘制

总酚测定的标准曲线绘制结果如图1所示。标准曲线方程为y=8.5149x-0.4992，R2=0.996 2，线性关系良好。

总酚测定的标准曲线

单因素试验

发酵菌株的组合

发酵菌株综合因素的实验结果如下图所示。与最小值相比，1株酿酒酵母、4株酿酒酵母+醋酸杆菌、6株醋酸杆菌+植物乳杆菌和7株酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳杆菌之间存在显著差异。其他五个温度等级之间有显著差异，其他五个时间等级之间有显著差异。b发酵温度和发酵时间，三因素三水平)进行正交试验，结果如下表所示。

荔枝酵素发酵L9正交试验结果

综合分析，荔枝酵素发酵工艺最佳组合方案为A3B2C2，速食菌种组合为酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳杆菌，发酵温度为30℃，发酵时间为48h。在此条件下，三次重复验证试验结果表明，荔枝酵素的总酚含量达到5.894±0.106μg/ml，是荔枝汁的1.54倍。

荔枝酵素中的酚类化合物

采用正交试验确定的最佳工艺发酵荔枝酶，并对发酵后的荔枝酶进行高效液相色谱分析。5种酚类化合物的保留时间分别为:峰1绿原酸、峰2阿魏酸、峰3柚皮苷、峰4柚皮素、峰5橙皮苷。与荔枝汁原液相比，荔枝酶原液中酚类物质的总含量和种类显著增加。

荔枝酶中酚类化合物的高效液相色谱分析

荔枝酵素中至少有24种酚类化合物:荔枝酵素原液中检出5种，其中峰3按标准保留时间可鉴定为柚皮苷，含量为0.944μg/ml；荔枝酵素5倍浓缩液中检出16种。在20倍浓缩液中检测到3种荔枝酵素。

讨论

酚类化合物具有很强的抗氧化活性，是水果中重要的生物活性功能因子之一。微生物发酵可以改变水果酶中总酚的含量和酚的种类组成。例如，新鲜腰果果汁经植物乳杆菌发酵后，总酚含量和单宁的种类和含量会随着发酵过程而动态变化；在全细胞发酵过程中，葡萄酒酵母、醋酸杆菌和植物乳杆菌对西番莲果汁进行催化，分别新生成4种、6种和7种酚类化合物。干桂圆肉水提物经酿酒酵母、醋酸杆菌和植物乳杆菌发酵后，桂圆发酵液中总酚含量提高了5.05倍，至少含有20种酚类化合物，其中至少有16种是新形成的。

本研究中，经酿酒酵母、醋酸杆菌和植物乳杆菌发酵后，荔枝酶的总酚含量是荔枝汁的1.54倍，荔枝汁中检测到的14种酚类化合物中，有13种经发酵后完全转化为其他酚类化合物。这些结果表明，微生物发酵可以改变果酶中总酚含量和酚的种类组成，通过优化菌种和发酵工艺，对富含特定酚类化合物、具有特定功能的果酶进行针对性的研发是可行的。

本研究及其他类似研究表明，果酶发酵过程中酚类化合物存在复杂的转化，但果酶发酵过程中酚类化合物的生物转化机制有待进一步研究和阐明。在后续研究中，有必要引入质谱、核磁共振等分析方法，对荔枝汁和荔枝酵素中的未知酚类化合物进行准确表征，进而通过对比分析和实验验证，建立酚类化合物的生物转化模式，为最终建立富含特定酚类化合物的荔枝酵素代谢控制发酵工艺奠定理论基础。

结论

优化发酵工艺可以显著提高荔枝酵素中总酚的含量，改善其功能特性。荔枝酵素的优化发酵工艺为:发酵剂菌种组合为酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳杆菌，接种量为10%，发酵温度为30℃，发酵时间为48h。在此条件下，荔枝酵素的总酚含量达到5.894±0.106μg/ml，是荔枝汁的1.54倍。