ngago 普渡大学团队：NgAgo有基因编辑能力 韩春雨事件核心争议技术迎最新研究进展

原标题:普渡大学团队:NgAgo有基因编辑能力！韩春雨事件核心争议技术的最新研究进展

2019年4月4日，预印本网站BioRxiv发表了美国普渡大学团队的一篇文章。题为《NgAgo增强大肠杆菌同源重组由DNA 1内切核酸活性介导》一文主要阐述了NgAgo内切核酸酶活性介导和增强大肠杆菌同源重组，即NgAgo具有内切DNA的能力。

NgAgo是韩春雨论文造假的核心蛋白因子。NgAgo能否用作真核生物中切割DNA的DNA导向内切酶，也是韩春雨论文造假中最关键的问题之一。

涂大学论文

NgAgo于2016年进入公众视野。当时，以韩春雨为首的对NgAgo的研究不仅在国内掀起了一轮“造星运动”，还引发了随之而来的强烈反弹关注和论文造假风波。2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨作为通讯作者，在国际知名学术期刊《自然生物技术》上发表了题为《利用北约细菌gregoryi Argonaute进行DNA引导的基因组编辑》的研究论文。本文主要描述了NgAgo的DNA引导基因组编辑并阐明其原理。这一发现被誉为继CRISPR-Cas9基因编辑技术之后的又一个“强大”的基因编辑工具。

图|河北科技大学副教授韩春雨

2016年7月29日，澳大利亚科学家Gaetan Burgio发表长文称，韩春雨论文中的一些结果不能重复；国际转基因技术协会向会员群发邮件，警告大家“NgAgo不能编辑哺乳动物细胞中的基因，所以不要浪费时间、金钱、人力和任务”。这一新的发展随后被国内多家媒体报道，而NgAgo的争议也因学术界的国际化和特殊社会关注的普及而升温。

2016年8月2日，Nature Biotechnology首次就该争议表态。“许多研究人员已经联系了该杂志，称这项研究不能重复。本杂志将按照既定流程对此事进行调查。”8月8日，《自然》杂志对此提出争议，并做了专门的新闻报道，称要求匿名的科学家向《自然》记者证实了实验的可重复性。河北科技大学表示，一个月内，韩春雨将采取适当形式公开核查，届时将有权威第三方作证。8月9日，在非营利组织Addgene的要求下，韩春雨发布了新版本的协议。直到2017年8月3日，Nature Biotechnology发表声明，撤回了韩春雨团队于2016年5月2日在本刊发表的论文。随着征兵退出的宣布，这场风暴结束了。

NgAgo的三维重建

那么，普渡大学的最新研究能否回答人们之前对NgAgo的疑问呢？

在了解NgAgo之前，让我们先了解一下pAgo。PAgo，即原核生物Argonautes，类似于成熟的CRISPR-Cas基因编辑系统，它还通过与导向单链核酸结合，切割其导向链识别的目标链，完成对目标DNA的编辑。

然而，与CRISPR-Cas基因编辑不同，pAgo不需要与靶基因相邻的前间隔序列相邻的额外短的DNA片段

理论上，它可以编辑任何序列的DNA，而不受PAM的限制。由于其在DNA编辑方面的巨大潜力，被研究者誉为基因编辑的“万能钥匙”。然而，由于深入的研究和技术原因，pAgo从未开发出像CRISPR-Cas那样简单实用的准商业化产品。

NgAgo作为pAgo的候选物，是近几年才逐渐被发现和纯化的，但之前的研究并没有让各国科学家意识到它具有DNA内切酶的功能。该分子来源于嗜盐古菌，一种古老的原核生物，细胞内表达量低，但在非嗜盐宿主中复性后没有DNA编辑功能。

此前的研究也证实，折叠后的NgAgo在体外不能完成DNA编辑，但在37℃时可以在细菌中具有基因组编辑功能。然而，普渡大学的这项研究表明，NgAgo确实具有DNA内切酶的功能。

NgAgo的氨基酸序列分析

普渡大学的整个实验思路如下:第一，提纯NgAgo。在这个阶段，研究小组重建了NgAgo基因，GST和his标签作为载体，转化细菌，在22℃培养，由IPTG诱导，发现表达的NgAgo表现出可溶性和包涵体的混合表达。纯化后的NgAgo分子分别用镍柱和谷胱甘肽琼脂糖柱层析纯化，得到可溶性和重折叠的产物。同时，根据氨基酸序列，用计算机进行分子三维重建。结果表明，NgAgo具有常规的N末端和PIWI、MID和PAZ结构域，也具有潜在的单链DNA结合结构域。

随后，在体外测试了纯化的NgAgo的活性和功能。他们发现具有非折叠结构的可溶性NgAgo分子在体外具有随机切割DNA的功能。

图中显示了NgAgo的两个辅助域，repA和PIWI

具体来说，这个分子每个结构域的不同功能是什么？

研究人员首先利用repA敲除子和repA突变体分析了repA结构域的功能，发现repA主要负责识别和切割质粒DNA。随后对PIWI结构域的功能测定表明，结果与repA相似，也具有DNA切割作用。因此，负责实验的Kevin V. Solomon教授得出结论，NgAgo是一种核酸内切酶，依靠repA和PIWI实现其DNA消化功能。

由于哺乳动物体内存在组蛋白，可以抑制pAgo的活性，研究人员选择在大肠杆菌中测试NgAgo的功能，结果显示NgAgo可以在大肠杆菌中切割DNA，同时更详细的研究表明，PIWI结构域对于靶向切割并没有那么重要，它可以随机切割一部分DNA，但对于调控NgAgo的整体功能非常重要。此外，repA域主要负责定向剪切。在原核生物中，两个结构域PIWI和热蛋白对NgAgo实现其核酸内切酶功能非常重要。

根据普渡大学的研究结果，NgAgo在体内外都可以实现其DNA内切酶功能。在体外实验中，可溶性和非重折叠的NgAgo可以切割目标DNA链。借助于两个功能域repA和PIWI，NgAgo可以通过诱导其蛋白质中靶序列的双链断裂来增强大肠杆菌中基因的同源重组。

这些研究证实了NgAgo确实是一种DNA内切酶，也说明可溶性NgAgo可以切割靶区的DNA。在这个过程中，PIWI域的缺失会使目标基因难以识别，进而降低NgAgo的DNA剪切力。

刘东团队发现NgAgo诱导的fabp11a基因敲除会导致斑马鱼眼睛发育缺陷

在普渡大学进行这项研究之前，国内关于NgAgo的研究进展有两个，也值得注意。

2016年11月，国内南通大学刘东团队的研究结果表明，NgAgo在gDNA的指导下可以与目的基因结合，同时抑制目的基因的转录过程，从而降低目的基因的表达水平。但该团队也否认NgAgo具有DNA消化功能但不具有DNA编辑功能。本文发表于《细胞研究》杂志2016年11月11日。

令人惊讶的是，2019年1月22日，中国学者张安定教授的研究团队发布了pAgo能够增强细菌同源序列定向重组的结果，证实了NgAgo系统通过其PIWI样结构域与重组酶A相互作用，从而增强了recA介导的DNA链重组。他们的研究揭示了一种细菌基因编辑系统，可以增强同源序列指导。这项研究发表在《核酸研究》杂志上。

展示了多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌中NgAgo基因的编辑系统

以上研究均表明NgAgo具有可编程的DNA切割能力。但需要注意的是，作为基因编辑应用的有力工具，NgAgo在真核宿主中仍存在一些挑战:离靶活性高、随机剪切率高、表达量低和潜在活性低。然而，进一步的研究可能会使用蛋白质来克服这些障碍，并开发NgAgo作为基因编辑的强大工具。

对于NgAgo科学家的最新进展，中国科学院遗传与发育研究所高级工程师江涛告诉DeepTech，这项工作还很初步，很多实验结果并不理想。

“比如大肠杆菌表达的NgAgo蛋白存在包涵体，包涵体复性不成功，所以可溶性部分不能排除折叠不正确的NgAgo。同时也没有NgAgo的纯度数据和证据，大肠杆菌本身有很多活性很高的内切酶，必须彻底清除。这种实验需要足够的阴性和阳性对照药物，我没有看到完整的实验证据。整个工作最有价值的部分是提高目标基因在大肠杆菌细胞中的重组率，这是一个旁证。遗憾的是，基因组编辑是否真实，并没有被后续的DNA测序结果直接证明。NgAgo作为成熟的基因组编辑工具的基本条件是NgAgo能否在真核细胞中实现DNA内切酶。我个人认为，目前的结果很难通过严格的同行评审，所以我们必须改进和补充我上面提出的一些重要实验，”他说。

他透露，许多科学家都意识到NgAgo的潜在优势——它不受额外相邻序列的限制，这意味着任何部分都可以编辑。我相信我国的韩春雨也注意到了，但是他并没有真的重复他声称的基因组编辑，其他科学家也没有按照他提供的方法对NgAgo进行基因组编辑。普渡大学的成绩是一个初步的结果，甚至是粗糙的，还需要完善和补充。如果可行，需要建立稳定可靠的实验条件，给出基因组编辑成功率和脱靶率的数据。

需要指出的另一点是，无论其他人在NgAgo上取得了什么新进展，韩春雨都需要重复他发表的实验。

综上所述，在之前的闹剧之后，一些学者还在努力开发NgAgo技术。普渡大学的最新成果再一次将NgAgo推向全球基因编辑研究人员的视野，显示出其作为DNA编辑工具的潜力。虽然这种“利器”还没有在真核生物中发现其固有的DNA编辑能力，但这一研究成果足以让研究者兴奋不已。相信随着对NgAgo的不断了解和发展，我们希望找到另一个强大的DNA编辑工具。

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参考:

Paula Pandolfi, Frederick S. Gimble, Kevin V. Solomon. NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity